多光子显微镜成像技能之五十一 快速同步多形式光学显微镜

  人类大脑由数百亿个神经元构成，这些神经元经过电信号与化学信号传递信息，是考虑、回忆、情感及行为等杂乱功用的生理根底。但是，长期以来，科学界缺少一种可以在无搅扰条件下，一起对神经元结构、代谢及生化改动高分辨率观测的东西。传统荧光符号或基因修改技能尽管功用强壮，但往往会改动细胞原有的生理状况，且难以同步捕捉多种生理进程。因而，开发一种无需符号、多模态、高速成像的技能，已成为神经科学与生物医学成像范畴的重要应战。

  图1.神经元微环境中的各种物理、代谢和生化改动[1]伊利诺伊大学香槟分校的Stephen Boppart团队提出了一种名为VAMPIRE的新式多模态显微镜体系，VAMPIRE全称为“Versatile Autofluorescence lifetime,Multiharmonicgeneration, Polarization-sensitive Interferometry, and Raman imaging in epi-detection”。该体系可以同步搜集四种不同的物理与化学信号：散射光：勘探细胞折射率改动，与电活动相关；双折射：表征细胞膜或纤维结构的取向改动；自发荧光：源自代谢辅因子NAD(P)H和FAD，评价细胞能量状况；拉曼散射：供给分子振荡信息，解析部分生化环境。一切信号均源自同一激光光源激起，经过精细的光路规划与核算成像技能，完成了同步、高速、高分辨率的成像。

  图2.VAMPIRE显微镜体系设备图[1]为完成上述多种信号的同步搜集，VAMPIRE体系整合了多种成像形式，包含光学相干显微镜（OCM）、多谐波成像、偏振灵敏干与丈量、自发荧光寿数成像（FLIM）以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）成像。体系选用钛宝石激光器作为激起光源，结合光子晶体光纤发生超连续谱，并运用傅里叶变换脉冲整形器在频域和时域调控斯托克斯光，完成多模态信号的同步搜集与处理。图2展现了VAMPIRE显微镜的体系结构。其间，灰色光路代表光学相干显微镜模块。该模块根据低相干干与原理，经过勘探从样品不同深度回来的散射光之间的干与信号，重建样品的微观结构。为完成高分辨率成像，体系要求光源具有较宽带宽。本体系选用钛宝石激光器作为激起光源，其间心波长为770 nm，重复频率为80 MHz。部分输出激光被耦合进入光子晶体光纤，发生带宽约200 nm的超连续谱。随后，一系列偏振分束器、二向色镜等将该光束分光与合束，终究导入线性扫描设备。在CARS成像模态中，绿色光路代表斯托克斯光，粉色光路代表泵浦光。将1.3 W、1045 nm的激光注入光子晶体光纤，可发生跨度达200 nm（基底宽度）的超连续谱。该体系选用定制规划的傅里叶变换脉冲整形器，该器材由衍射光栅与空间光调制器构成，可以独立调控斯托克斯光在不同波长下的振幅与相位，从而在保持飞秒脉冲宽度的一起保证光谱分辨率，该技能称为TOSS-CARS[2]。经整形后，斯托克斯光被调控至掩盖数个特定振荡频率（如2830 cm, 2930 cm等），别离与泵浦光效果，完成对CH弹性振荡区等不同生化组分的特异性成像。此外，体系另一路770 nm飞秒激光用于激起FAD与NAD(P)H的自发荧光，并发生二次谐波信号。各成像模态经过精细装备的滤光片体系搜集信号，各成像通道信号经滤光片体系有用别离，光谱堆叠得以最小化，证明了体系光路规划的合理性。

  图3.运用VAMPIRE显微镜拍照的小鼠大脑皮层邻近切片的图画[1]研究人员运用VAMPIRE体系对小鼠大脑皮层及视网膜切片成像（图3），展现了其在解析神经元微环境结构、代谢与生化特性方面的强壮才能。例如，在脑切片中参加谷氨酸影响后，体系成功捕捉到不同神经元集群的动态呼应，并经过聚类分析识别出五种具有不一样代谢呼应形式的区域，进一步与CARS提醒的脂质/蛋白质份额相相关，表现了多模态成像在相关结构与功用方面的优势。